CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9）核酸酶表達(dá)載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一（另外兩種是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位點快速有效地產(chǎn)生突變。這些質(zhì)粒載體編碼的特異性RNA，能夠引導(dǎo)DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點的DNA序列。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過與基因組中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。為了方便使用，我們設(shè)計的CRISPR/Cas9載體能夠在一個載體上同時有效表達(dá)Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引導(dǎo)RNA（gRNA）。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標(biāo)細(xì)胞同時表達(dá)Cas9和特異gRNA。這可以通過在同一個載體上共表達(dá)Cas9和gRNA，也可以通過在兩個載體各上自表達(dá)Cas9和gRNA來實現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個載體分開表達(dá)的優(yōu)勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas9），這取決于用戶的實驗?zāi)康摹４送?，使用單獨的Cas9表達(dá)載體有利于生產(chǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株或者動物模型，然后使用不同的gRNA進(jìn)行打靶。這種方式比起gRNA/Cas9共表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)可以獲得更高的打靶效率。

Cas9表達(dá)慢病毒載體可以高效地將Cas9基因通過病毒顆粒導(dǎo)入使用質(zhì)粒方式難轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞。Cas9慢病毒載體首先以質(zhì)粒的方式構(gòu)建并使用E. coli擴增，然后與多個輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞。載體上的兩個LTR區(qū)域之間的DNA序列將被轉(zhuǎn)錄成RNA，而輔助質(zhì)粒表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)一步與這些RNA組裝形成完整的病毒顆粒。有活性的病毒顆粒被釋放到上清液中。病毒上清液可直接轉(zhuǎn)染或者濃縮后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。當(dāng)病毒感染靶細(xì)胞時，病毒RNA被反轉(zhuǎn)錄成DNA，然后永久性整合到宿主基因組，實現(xiàn)用戶選擇的啟動子驅(qū)動下的Cas9蛋白表達(dá)。

通過改造優(yōu)化，我們的慢病毒載體刪除了與病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因（這些基因由輔助質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，用于病毒包裝過程），使其產(chǎn)生的慢病毒顆粒是復(fù)制缺陷型的（即病毒只能用以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞但是不能自我復(fù)制），具有很高的生物安全性。

我們提供多種版本的來源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，包含D10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域后，如dCas9/KRAB，可分別應(yīng)用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯開，形成粘性末端）。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的Cas9表達(dá)慢病毒載體由第三代慢病毒載體系統(tǒng)衍生而來。經(jīng)優(yōu)化，該載體系統(tǒng)在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，包裝的活病毒具有很高的滴度，對大多數(shù)宿主細(xì)胞具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能有效地把載體整合到靶細(xì)胞基因組并實現(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。Cas9表達(dá)慢病毒載體可實現(xiàn)用戶自定義啟動子驅(qū)動下的高水平Cas9表達(dá)。我們可提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。

靈活性：單Cas9表達(dá)載體可以與多個不同的gRNA共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞打靶多個位點。此外，單Cas9表達(dá)載體可以通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。經(jīng)FACS或抗生素篩選后，Cas9高水平表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可被用來接受gRNA轉(zhuǎn)染從而獲得高效的打靶率。

滴度高：我們的病毒載體可以包裝出高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務(wù)，病毒滴度可以達(dá)到>10⁹ TU/ml。在這樣的病毒滴度下，如果選擇合適的劑量去轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，則轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可接近100%。

宿主范圍廣泛：我們的病毒包裝系統(tǒng)包裝出來的病毒含有VSV-G包膜蛋白，此蛋白擁有非常廣泛的親和性，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎所有的哺乳動物細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞，非分裂細(xì)胞，原代細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞系，干細(xì)胞，分化細(xì)胞，貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞等各類哺乳動物細(xì)胞，甚至還可以轉(zhuǎn)導(dǎo)一些非哺乳動物細(xì)胞。使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞是非常難的，但是采用我們慢病毒載體系統(tǒng)可以輕易的實現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。相對于在某些細(xì)胞中具有較低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的腺病毒和不能用于非分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒而言，利用我們的慢病毒包裝系統(tǒng)包裝出來的病毒具有廣泛的親和性。

基因拷貝數(shù)相對均一：通常情況下，采用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式可以比較均一的將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中，而傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染則呈現(xiàn)出較高的不均一性，導(dǎo)致某些細(xì)胞會獲得較多拷貝質(zhì)粒而某些則會獲得較少甚至完全沒有。

體內(nèi)外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，同樣適用于體內(nèi)活體動物實驗。

安全性：我們的病毒載體系統(tǒng)具備了以下兩大特點，因而具有非常高的安全性。一、病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的基因由三個輔助質(zhì)粒分開表達(dá)。二、5' LTR的啟動子自失活。因此，在進(jìn)行病毒包裝和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的時候不會產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒顆粒，使用我們的載體對人體的健康威脅也是最低的。

技術(shù)復(fù)雜：使用慢病毒載體時，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。因此慢病毒轉(zhuǎn)染相對于常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，技術(shù)難度更高，周期更長。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點時對gRNA識別序列3'端的PAM序列有嚴(yán)格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives transcription of viral RNA in packaging cells. This RNA is then packaged into live virus.

5' LTR-ΔU3: A deleted version of the HIV-1 5' long terminal repeat. In wildtype lentivirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that in wildtype virus, the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. On our vector, Δ5' LTR is deleted for a region that is required for the LTR's promoter activity normally facilitated by the viral transcription factor Tat. This does not affect the production of viral RNA during packaging because the promoter function is supplemented by the CMV promoter engineered upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response element. It allows the nuclear export of viral RNA by the viral Rev protein during viral packaging.

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract. It creates a "DNA flap" that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection. This improves vector integration into the host genome, resulting in higher transduction efficiency.

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. It enhances viral RNA stability in packaging cells, leading to higher titer of packaged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

3' LTR-ΔU3: A truncated version of the HIV-1 3' long terminal repeat that deletes the U3 region. This leads to the self-inactivation of the promoter activity of the 5' LTR upon viral vector integration into the host genome (since 3' LTR is copied onto 5' LTR during viral integration). The polyadenylation signal contained in ΔU3/3' LTR serves to terminates all upstream transcripts produced both during viral packaging and after viral integration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It further facilitates transcriptional termination after the 3' LTR during viral RNA transcription during packaging. This elevates the level of functional viral RNA in packaging cells, thus improving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.